Rešitve

Namen aktivnosti: Spoznati in izvesti kvantitativno določanje beljakovin v vzorcu s Folin-Lowryjevo metodo, ki temelji na določanju vsebnosti peptidnih vez in aromatskih aminokislin (triptofana in tirozina).

Material in oprema:

• goveji serumski albumin (BSA, 50 mg/l)
• vzorec za analizo
• fiziološka raztopina
• Lowryjev reagent
• Folinov reagent
• avtomatske pipete z nastavki
• epruvete, čaše, Pasteurjeve pipete, kivete
• spektrofotometer

Postopek:

1. Priprava vzorca:
   • Razredči 0,5 g ali 0,5 ml vzorca v 4,5 ml fiziološke raztopine (neredčen vzorec).
   • Pripravi po 0,5 ml 5-, 50- in 500-kratne redčine vzorca z razredčevanjem s fiziološko raztopino.
2. Priprava umeritvene krivulje:
   • V epruvetah pripravi 0,5 ml standardnih raztopin BSA z koncentracijami 50, 40, 30, 20, 10 in 0 mg/l (redči s fiziološko raztopino).
3. Reakcija:
   • V novo epruveto prenesi 0,25 ml standardne ali vzorčne raztopine, dodaj 0,35 ml Lowryjevega reagenta, premešaj in pusti stati 20 min.
   • Nato dodaj 0,05 ml Folinovega reagenta (slika 1), ponovno premešaj in inkubiraj v temi 60 min.
4. Merjenje:
   • Prenesi raztopino v kiveto (slika 2) in izmeri absorbanco pri 750 nm s spektrofotometrom (slika 3).
5. Analiza rezultatov:
   • Nariši umeritveno krivuljo glede na absorbanco in koncentracijo standardov.
   • Na podlagi umeritvene krivulje določi koncentracijo beljakovin v vzorcih.

Vaja je primerna za delo v parih. Med izvajanjem beležite vse meritve, opažanja in izračune. Po zaključku vaje izdelajte poročilo z izračunanimi koncentracijami beljakovin in interpretacijo rezultatov.

S tem postopkom boste pridobili praktične izkušnje s kolorimetričnim določanjem beljakovin, kar je ključna tehnika v biokemiji in molekularni biologiji.

Viri:

1. https://studentski.net/get/ulj_fkt_ke1_al1_vaj_navodila_za_laboratorijske_vaje_2013_2014_01.pdf
2. https://studentski.net/get/ulj_fkt_bi1_bpr_vaj_bradfordova_metoda_01__porocilo.pdf
3. https://en.wikipedia.org/wiki/Lowry_protein_assay
4. https://animal.ifas.ufl.edu/media/animalifasufledu/hansen-lab-website/lab-protocols/lowry_protein_assay.pdf
5. https://fkkt.uni-lj.si/fileadmin/user_upload/o_fakulteti/e_gradiva/Kemijska_analiza_zivil-2006-Prosen_Cigic.pdf
6. https://www.youtube.com/watch?v=qJsv78m-VOA
7. https://www.scribd.com/document/681735670/Navodila-Biokemija-BIOPSIHOLOGI
8. https://www.fkkt.um.si/egradiva/fajli/gradiva.pdf
9. https://journalsp.com/wp-content/uploads/2022/10/Word-Template_Sample.pdf
10. https://dijaski.net/get/bio_vaj_alkoholno_vrenje_07.pdf

Slika 1: Reakcija Folinovega reagenta z amino skupino.  https://en.wikipedia.org/wiki/Folin%27s_reagent